DNAシークエンシングは、 ゲル電気泳動を使用して、サイズが異なる1本のDNA鎖を1塩基対だけ分離する能力にも左右されます。
DNAシーケンシング
1970年代後半に、より長いDNA分子に対する2つのDNA配列決定技術が発明された。 これらは、 サンガー （またはジデオキシ）法およびマキサム - ギルバート （化学的開裂）法であった。 Maxam-Gilbert法は、化学物質によるヌクレオチド特異的切断に基づいており、オリゴヌクレオチド（短いヌクレオチドポリマー、通常50塩基対未満の長さ）を配列するのに最適です。 サンガー法は、技術的に適用が容易であることが証明されており、技術の自動化および自動化の出現により、いくつかの遺伝子全体を含むDNAの長い鎖に容易に適用されるため、より一般的に使用されている。 この技術は、PCR伸長反応中のジデオキシヌクレオチドによる連鎖停止に基づく。
サンガー法
サンガー法では、分析するDNA鎖を鋳型としてDNAポリメラーゼを用いてPCR反応を行い、プライマーを用いて相補鎖を生成させる。
4つの異なるPCR反応混合物を調製し、それぞれ4つのヌクレオチドの1つ（ATP、CTP、GTPまたはTTP）に対するジデオキシヌクレオシド三リン酸（ddNTP）類似体の一定割合を含む。 新しいDNA鎖の合成は、これらの類似体の1つが組み込まれるまで続き、その時点で鎖は時期尚早に切断される。
各PCR反応は、DNAストランドの異なる長さの混合物を含有して終了し、そのすべてはその反応のためにジデオキシ標識されたヌクレオチドで終わる。 次いで、ゲル電気泳動を用いて、4つの別個のレーンで4つの反応の鎖を分離し、鎖の長さがどのヌクレオチドで終わるかに基づいて元の鋳型の配列を決定する。
自動サンガー反応では、4つの異なる色の蛍光タグで標識されたプライマーが使用される。 異なるジデオキシヌクレオチドの存在下でのPCR反応は、上記のように行われる。 しかし、次に、4つの反応混合物を合わせて、ゲルの単一のレーンに適用する。 各断片の色は、レーザービームを用いて検出され、情報は、各色についてピークを示すクロマトグラムを生成するコンピュータによって収集され、そこから鋳型DNA配列が決定され得る。
典型的には、自動配列決定法は、最大約700〜800塩基対の長さの配列についてのみ正確である。 しかし、Primer Walkingやショットガンシーケンシングのような段階的な方法を用いて、より大きな遺伝子、そして実際には全ゲノムの完全な配列を得ることが可能です。
Primer Walkingでは、より大きな遺伝子の実行可能な部分がサンガー法を用いて配列決定される。 新しいプライマーは、配列の信頼できるセグメントから生成され、元の反応の範囲外であった遺伝子の部分の配列を続けるために使用される。
ショットガンシーケンシングは、目的のDNAセグメントをより適切な（管理可能な）サイズのフラグメントにランダムに切断し、各フラグメントをシーケンシングし、重複シーケンスに基づいてフラグメントを配置することを伴う。 この技術は、重複部分を配置するためのコンピュータソフトウェアのアプリケーションによって容易にされている。