DNAの塩基配列決定と遺伝子増幅に関するPCRの役割
ポリメラーゼ連鎖反応（ PCR ）は、遺伝子の複数のコピーを作製するための分子遺伝学的手法であり、遺伝子配列決定プロセスの一部でもある。
ポリメラーゼ連鎖反応はどのように機能するのですか？
遺伝子コピーはDNAのサンプルを使用して作成され、この技術は、サンプル中に見出される遺伝子の単一のコピーから複数のコピーを作成するのに十分適している。 数百万コピーを作製するための遺伝子のPCR増幅は、DNA断片のサイズおよび電荷（+または - ）に基づく視覚技術を用いて遺伝子配列の検出および同定を可能にする。
制御された条件下で、DNAの小さなセグメントは、DNAポリメラーゼとして知られている酵素によって生成され、「テンプレート」として知られるDNA断片に相補的なデオキシヌクレオチド（dNTP）を付加する。 「プライマー」と呼ばれるさらに小さなDNA断片も、ポリメラーゼの出発点として使用されます。 プライマーは、人工DNA（オリゴマー）の小片であり、通常15〜30ヌクレオチド長である。 それらは、増幅される遺伝子の非常に端にある短いDNA配列を知っているか、または推測することによって作られる。 PCR中、配列決定されているDNAを加熱し、二本鎖を分離する。 冷却すると、プライマーは鋳型に結合し（アニーリングと呼ばれる）、ポリメラーゼが始まる場所を作り出す。
PCR技術
好熱菌および好熱性ポリメラーゼ酵素（高温での加熱後に構造的完全性および機能性を維持する酵素）の発見により、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を可能にした。
PCR技術に含まれるステップは以下の通りである。
- 最適化された濃度のDNAテンプレート、ポリメラーゼ酵素、プライマー、およびdNTPを含む混合物を作製する。 酵素を変性させることなく混合物を加熱する能力は、摂氏94度の範囲の温度でDNA試料の二重らせんを変性させる。
- 変性に続いて、試料は、約54度の比較的緩やかな範囲に冷却され、プライマーの一本鎖DNA鋳型へのアニーリング（結合）が促進される。
- サイクルの第3段階では、試料を伸長のためにTaq DNAポリメラーゼの理想温度である72℃に再加熱する。 伸長の間、DNAポリメラーゼは、各プライマーの3 '末端に相補的なdNTPを付加し、関心のある遺伝子の領域に二本鎖DNAのセクションを生成するための鋳型としてDNAの最初の一本鎖を使用する。
- 正確に一致していないDNA配列にアニーリングしたプライマーは、72度でアニーリングされず、したがって関心のある遺伝子への伸長を制限する。
変性、アニーリングおよび伸長のこのプロセスは、複数回（30〜40回）繰り返され、それにより、混合物中の所望の遺伝子のコピー数を指数関数的に増加させる。 このプロセスは手作業で行うのは非常に面倒ですが、ほとんどの分子実験室では一般的なプログラム可能なサーマルサイクラーでサンプルを調製し、インキュベートし、完全なPCR反応を3〜4時間で行うことができます。
各変性工程は、前のサイクルの伸長プロセスを停止させ、DNAの新しい鎖を切断し、それを所望の遺伝子のサイズにほぼ維持する。
伸長サイクルの持続時間は、関心対象の遺伝子のサイズに依存してより長くまたはより短くすることができるが、最終的に、PCRの反復サイクルによって、テンプレートの大部分は、関心対象の遺伝子のサイズだけに制限される両方のプライマーの産物から生成されるであろう。
結果を増強するために操作することができる成功したPCRのためのいくつかの異なる因子がある。 PCR産物の存在を試験するための最も広く使用される方法は、 アガロースゲル電気泳動である 。 これはサイズと電荷に基づいてDNA断片を分離するために使用されます。 次に、断片を色素または放射性同位元素を用いて視覚化する。
進化
PCRの発見以来、元のTaq以外のDNAポリメラーゼが発見されている。 これらのうちのいくつかは、より良好な「校正」能力を有するか、またはより高温でより安定であり、したがってPCRの特異性を改善し、誤ったdNTPの挿入によるエラーを減少させる。
PCRのいくつかのバリエーションは特定の用途のために設計されており、現在は分子遺伝学的実験室で定期的に使用されている。 これらのうちのいくつかは、リアルタイムPCRおよび逆転写酵素PCRである。 PCRの発見はまた、DNA配列決定、 DNAフィンガープリンティングおよび他の分子技術の開発につながる。