必要とされるタンパク質純度の程度は、タンパク質の意図される最終用途に依存する。
用途によっては、粗抽出液で十分です。 しかし、食品や医薬品などの他の用途では、高純度が要求される。 これを達成するために、一連の精製工程において、いくつかのタンパク質精製法が典型的に使用される。
各タンパク質精製工程は、通常、ある程度の製品損失をもたらす。 従って、理想的なタンパク質精製戦略は、最少限の段階で最高レベルの精製に達する方法である。 使用するステップの選択は、標的タンパク質のサイズ、電荷、溶解度および他の特性に依存する。 以下の技術は、単一の細胞質ゾルタンパク質を精製するために最も適切である。 サイトゾルタンパク質複合体の精製はより複雑であり、通常、異なる方法を適用する必要がある。
タンパク質精製の第一歩
細胞内 （ 細胞内 ）タンパク質を精製するための最初のステップは、 粗抽出物の調製である。
この抽出物は、細胞質からのすべてのタンパク質、およびいくつかのさらなる巨大分子、補因子および栄養素の複雑な混合物を含むであろう。 粗抽出物はバイオテクノロジーのいくつかの用途に使用することができるが、純度が問題であれば、その後の精製工程に従わなければならない。
粗タンパク質抽出物は、細胞溶解によって生成される細胞残屑の除去によって調製され、これは、化学物質および酵素 、超音波処理またはフレンチプレスを使用して達成される。 破片を遠心分離によって除去し、上清を回収する。 細胞外タンパク質の粗調製物は、遠心分離によって細胞を単に除去することによって得ることができる。
特定のバイオテクノロジーのアプリケーションでは、 耐熱性酵素が求められています。変性せずに高温に耐えられる酵素であり、高い比活性を維持します。 それらを産生する生物は、極限動物と呼ばれることもあります。 耐熱性タンパク質を精製するための簡単なアプローチは、混合物中の他のタンパク質を加熱し、次いで溶液を冷却することによって変性させることである（熱安定性酵素を必要に応じて改質または再溶解させる）。
中間精製工程
過去に、粗抽出物からタンパク質を精製するための共通の第2のステップは、高浸透圧を有する溶液（すなわち塩溶液）中での沈殿によるものであった。 粗抽出物中の核酸は、硫酸ストレプトマイシンまたは硫酸プロタミンで形成された凝集物を沈殿させることによって除去することができる。
タンパク質沈殿は、通常、硫酸アンモニウムを塩として用いて行われる。
硫酸アンモニウムの異なる濃度で異なるタンパク質が沈殿する。 一般に、高分子量のタンパク質は、より低い濃度の硫酸アンモニウム中に沈殿する。 塩沈殿は、通常、高度に精製されたタンパク質に至らないが、混合物中の望ましくないタンパク質を除去し、試料を濃縮するのを助けることができる。 次いで、溶液中の塩を、多孔性セルロースチューブ、濾過、またはゲル排除クロマトグラフィーによる透析によって除去する。
現代のバイオテクノロジープロトコルは、標準的な手順のための既製のソリューションを提供する多くの市販キットを利用することが多い。 タンパク質の精製は、しばしば、フィルターおよび調製されたゲル濾過カラムを用いて行われる。 指示に従って、適切な量の適切な溶液を加え、溶離液（カラムの他端から出てくるもの）を新しい試験管に集めながら指定の時間だけ待ってください。
- クロマトグラフィー法は、ベンチトップカラムまたは自動HPLC装置を使用して適用できます。 HPLCによる分離は、逆相、イオン交換またはサイズ排除法、およびダイオードアレイまたはレーザー技術によって検出された試料によって行うことができる。
タンパク質の可視化と精製の評価
- 逆相クロマトグラフィー （RPC）は、相対的な疎水性に基づいてタンパク質を分離する。 この技術は高度に選択的であるが、有機溶媒の使用を必要とする。 いくつかのタンパク質は溶媒によって永久的に変性され、RPC中に機能を失います。 したがって、この方法は、特に標的タンパク質が活性を保持する必要がある場合には、すべての用途には推奨されない。
- イオン交換クロマトグラフィーは、 電荷に基づくタンパク質の分離を指す。 カラムはアニオン交換またはカチオン交換用に調製することができる。 アニオン交換カラムは、負に荷電したタンパク質を引き付ける正電荷を有する固定相を含む。 陽イオン交換カラムは、正に荷電したタンパク質を引き付ける逆の負に荷電したビーズである。 標的タンパク質の溶出は、各タンパク質の荷電官能基の変化または中和をもたらす、カラム中のpHを変化させることによって行われる。
- サイズ排除クロマトグラフィー（ ゲルろ過 ）は、より大きな分子がクロマトグラフィーカラム中の架橋ポリマーをより速く移動するので、より大きなタンパク質を小さなものから分離する。 大きなタンパク質はポリマーの細孔には適合しないが、より小さいタンパク質はクロマトグラフィーカラムを通過するのに時間がかかり、より直接的な経路は少ない。 溶離液は、溶出時間に基づいてタンパク質を分離する一連のチューブに集められる。 ゲル濾過は、標的タンパク質が最初にカラムに添加されたよりも小さい溶出体積で集められるので、タンパク質試料を濃縮するための有用なツールである。 コスト効率が高いため、大規模なタンパク質生産では同様のろ過技術を使用することがあります。
- アフィニティークロマトグラフィーは、タンパク質精製プロセスを「研磨する」または完了させるための非常に有用な技術である。 クロマトグラフィーカラム中のビーズは、標的タンパク質に特異的に結合するリガンドに架橋される。 その後、遊離リガンドを含む溶液ですすぐことにより、タンパク質をカラムから除去する。 この方法は他の技術と比較して最も純粋な結果と最も高い比活性を与えます。
- SDS-PAGEは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動であり、タンパク質に結合するSDS（ドデシル硫酸ナトリウム）の存在下で行われ、大きな正味の負電荷を与える。 全てのタンパク質の電荷はかなり等しいので、この方法はサイズに基づいてそれらをほとんど完全に分離する。 SDS-PAGEは、一連の各ステップの後にタンパク質の純度を試験するためによく使用されます。 望ましくないタンパク質が混合物から徐々に除去されるので、SDS-PAGEゲル上で視覚化されたバンドの数は、所望のタンパク質を表すただ1つのバンドが存在するまで減少する。
- イムノブロッティングは、アフィニティークロマトグラフィーと組み合わせて適用されるタンパク質視覚化技術である。 特定のタンパク質のための抗体は、アフィニティークロマトグラフィーカラム上のリガンドとして使用される。 標的タンパク質はカラム上に保持され、次いでカラムを塩溶液または他の薬剤ですすぐことによって除去される。 放射性標識または色素標識に連結された抗体は、それが混合物の残りから分離されると、標的タンパク質の検出を助ける。
ソース：
Zubay G. 1988. Biochemistry、2nd Edition。 Macmillan Publishing Co.、ニューヨーク、ニューヨーク、米国。
Amersham Pharmacia Biotech。 1999. Protein Purification Handbook、Edition AB。 Amersham Pharmacia Biotech Inc.、ニュージャージー、米国。 http://www.biochem.uiowa.edu/donelson/Database%20items/protein_purification_handbook.pdf。