ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）反応のいずれかの成分への調整は、生成物の収率および質の改善または低下、または反応の特異性および感度の改善のいずれかにより、結果の質を変える可能性がある。 最終結果に影響を与えるパラメータは、物理的（すなわち、温度、サイクル時間）または化学的（すなわち、テンプレート濃度、使用される酵素のタイプ）のいずれかであり得る。 以下は、PCRの成功に影響を与えるいくつかの重要な要因です。
01クリーンラボ条件
PCRはDNAの単一分子を検出することができるので、実験室で元の状態を維持することが重要である。 常に新鮮な手袋を着用し、滅菌ガラス器具、チューブ、ピペットチップ、滅菌溶液を使用し、作業を開始する前に作業領域を清掃してください。
結果が正確なサンプルの増幅によるものであることを確実にするために、鋳型DNAおよび酵素を含まないコントロール反応を常に含む。
ほとんどの人は、トラブルシューティングを簡単にするために共有されていない独自のソリューションを用意しています。また、指定されたピペットはPCR専用に用意されています。 DNaseおよびRNaseフリーPCRチューブ、エアロゾル耐性ピペットチップ、およびUV光によるヒュームフードでの作業も、問題を最小限にする方法です。
02化学成分
- 18〜24拠点あり
- 二次構造を持たない（すなわち、ヘアピンループ）
- G / CとA / Tのペアのバランスの取れた分布
- 3フィートの端でお互いに補完的ではない
- アニーリング温度（通常、55〜65℃）より5〜10℃程度高い融解温度（Tm）
最良の結果を得るためには、両方のプライマーのTmも同様でなければなりません。
03反応混合物：鋳型およびプライマー
最適なプライマー濃度は、0.1〜0.6マイクロモル/ Lである。 鋳型の量は、DNA（ヒト、細菌、プラスミド）の種類によって異なる。
テンプレートの量が非常に少ないため、サイクル数の増加や「ホットスタート」の使用など、結果を改善するための他の戦略があります。 ポジティブコントロール反応で常に新しいプライマーをテストし、特定の実験条件下で確実に機能するようにします。
04反応混合物：酵素活性
反応混合物中のMgCl 2の濃度はPCR結果に影響を及ぼし、より厳しい反応において重要な役割を果たす可能性がある。 マグネシウムカチオンはdNTPと可溶性の複合体を形成し、ポリメラーゼ酵素が認識する実際の基質を生成する。
全ての4つのdNTPが等量であれば、ポリメラーゼのエラー率を下げるのにも役立ちます。 ベタイン、BSA、界面活性剤、DMSO、グリセロール、およびピロホスファターゼなどの特定の添加物もまた、酵素特異性または反応効率に影響を与え得る。
05サーモサイクラーのタイプ
実験室機器を購入する際には、厳密で望ましい温度を維持するために、いくつかのサーモサイクラーが他のものよりも精度が低いことに注意してください。
これは、あなたが厄介な反応に直面したり、狭い範囲のアニーリング温度を必要とするプライマーを使用している場合、長期的には安くならない1つの領域です。
使用しているサーモサイクラーの正確なブランドに合うように設計された薄肉反応チューブは、反応温度を最適化するのにも役立ちます。
06サイクル設定
増加した収率は、より多くの鋳型を増幅するためのより少ない酵素を補うために、約20サイクルごとに伸長時間を増加させることによって達成することができる。 通常、エチジウムブロマイドで染色されたアガロースゲルを見るのに十分な濃度まで、10個未満の鋳型分子を増幅するには、40サイクル未満で十分である。