遺伝子クローニングは、単一の遺伝子のコピーまたはクローンを作製する行為である。 ひとたび遺伝子が同定されると、生物医学および産業研究の多くの分野でクローンを使用することができる。 遺伝子工学は、遺伝子を新しい生物にクローニングするか、タンパク質産物を変化させるためにDNA配列を変更するプロセスです。 遺伝子工学は、以下の必須手順を実行する能力に依存する。
01 ポリメラーゼ連鎖反応
02 制限酵素
制限エンドヌクレアーゼとして知られている酵素の発見は、 タンパク質工学にとって不可欠であった。 これらの酵素は、ヌクレオチド配列に基づいて特定の位置でDNAを切断する。 別個の部位でDNAを切断することができる何百もの異なる制限酵素が 、多くの異なる細菌株から単離されている。 制限酵素で切断されたDNAは、様々なサイズのより小さな断片を産生する。 これらは、ゲル電気泳動またはクロマトグラフィーを用いて分離することができる。
03電気泳動
細胞培養物からDNAを精製したり、制限酵素を使ってDNAを切断したりすることは、DNAを可視化できない場合、つまり抽出物に何かが含まれているかどうかを調べる方法を見つけたり、それを切った。 これを行う1つの方法は、ゲル電気泳動によるものである。 ゲルは切断されたDNAを見ることからDNAインサートおよびノックアウトを検出することまで、様々な目的のために使用される。
04 DNAの2つの部分を結合する
遺伝子研究では、DNAの2つ以上の個々の鎖を連結すること、組換え鎖を作製すること、または制限酵素で切断された環状鎖を閉じることがしばしば必要である。 DNAリガーゼと呼ばれる酵素は、ヌクレオチド鎖間に共有結合を作り出すことができる。 酵素DNAポリメラーゼIおよびポリヌクレオチドキナーゼはまた、このプロセスにおいて、ギャップを充填するため、または5 '末端をそれぞれリン酸化するために重要である。
05小さな自己複製DNAの選択
細菌ゲノムの一部ではないが、自己複製が可能な小さな円形のDNA断片は、プラスミドとして知られている。 プラスミドは、微生物間で遺伝子を輸送するためのベクターとしてしばしば使用される。 バイオテクノロジーでは、目的の遺伝子が増幅され、遺伝子とプラスミドの両方が制限酵素によって切断されると、これらは一緒に連結され、組換えDNAとして知られるものを生成する。 ウイルス（バクテリオファージ）DNAはまた、コスミド、バクテリオファージ遺伝子を含む組換えプラスミドも可能なベクターとして使用することができる。
06ベクターを宿主細胞に移動する方法
プラスミドなどのベクター上の遺伝物質を新しい宿主細胞に転移させるプロセスを形質転換といいます。 この技術は、宿主細胞をベクターに「適格」または一時的に透過性にする環境変化に曝露することを必要とする。 エレクトロポレーションはそのような技術の1つです。 プラスミドが大きいほど、それが細胞によって取り込まれる効率が低下する。 より大きなDNAセグメントは、バクテリオファージ、レトロウイルスまたは他のウイルスベクターまたはコスミドを用いてトランスダクションと呼ばれる方法でより容易にクローン化される。 ファージやウイルスベクターは再生医療によく使われますが、染色体の一部にDNAが挿入される可能性があります。そこでは、それが望ましくなく、合併症や癌を引き起こします。
07トランスジェニック生物を選択する方法
すべての細胞が形質転換中にDNAを取り込むわけではありません。 そういうものを検出する方法があることは不可欠です。 一般に、プラスミドは抗生物質耐性の遺伝子を有し、トランスジェニック細胞は、それらの遺伝子の発現およびその抗生物質を含む培地上で増殖する能力に基づいて選択することができる。 別の選択方法は、x-gal / lacZ系のような他のレポータータンパク質または緑色蛍光タンパク質の存在に依存し、これはそれぞれ色および蛍光に基づく選択を可能にする。